诺丽是怎样抑制肿瘤生长的

诺丽果汁，即由海巴戟植物的果实榨取的果汁，被用作药物已有数个世纪的历史。我们以人的胎盘血管和人类乳腺肿瘤作为血管生长的外植体来源，运用三维纤维蛋白凝块矩阵模型对诺丽果汁的效果进行了测试。相比于以生理盐水作为对照试验组，5%(体积分数)或更浓的诺丽果汁对胎盘血管外植体上新血管芽生长的抑制作用效果更为明显。该浓度的诺丽果汁对降低新毛细血管芽的生长速率和增殖速率效果也很显著。当在血管生长环境下使用浓度10%的诺丽果汁，几天内即可诱导肿瘤血管与毛细血管网终退化及凋亡。本研究也发现含10%诺丽果汁是人类乳腺肿瘤外植体的血管生长的良好抑制剂。在有血管生长的肿瘤外植体中，10%的诺丽果汁能在2到3天内促使肿瘤血管迅速退化及凋亡。

1 前言

血管生长的定义首先由福克曼在1971年提出，进一步发展了之前关于血管网络生长的理论。在普通成年人体内，血管生长常常与病理过程挂钩，除复发性增长与排卵期子宫内膜脱落外。在多样的病理条件下，如视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、伤口愈合、肿瘤生长，原本静态的血管内皮细胞会随之转化为血管生长的表现状态。曾有人认为，启动此血管生成“开关”的分子机制是打破了血管内皮生长因子和抑制因子自然的动态平衡状态。启动血管内皮细胞生长的“开关”，然后细胞外基质被水解降解，细胞随之迁移和增殖，进而形成毛细血管结构和彼此交联的血管网络，任何这些连续步骤的中断或不通畅都有可能阻止或改善以上病症的出现。为此，目前相关机构正在审查许多能够作为抗血管生成剂的化合物的功效。另外一种思路由此出现，即阻止血管生长对于新生成实体肿瘤的形成具有重要的抑制作用。这一方法的目标是为了使传递给肿瘤细胞的营养中止，导致胂瘤细胞由于营养缺失而发生凋亡。目前已有关于大量化合物，包括长春花生物碱，秋水仙素，长春花碱，黄酬醋酸( FAA)在中断肿瘤血管牛长的功效的研究报道，但是它们发挥功效需要较高的浓度，且常常导致病人产生严重的副作用。康普瑞汀A4磷酸盐可以破坏肿瘤血管，同时保留周围正常的血管组织，尽管周围血管区域的肿瘤仍然持续生长，但这一现象意味着此药剂作为佐剂可在常规疗法使用。理想情况下，作用于血管系统的抗癌药物会抑制新的血管生长，从而阻断肿瘤的扩展和转移，同时还可攻击原发肿瘤本身的血管。

海巴戟植株及其果实在南大西洋的岛屿上作为药用食物已有很长历史。萨摩亚和夏威夷的人们利用海巴戟果汁(诺丽果汁)治疗糖尿病，心脏病，高血压，肾病和膀胱疾病，而其果肉，树叶和树皮常常作为膏药治疗疮口，外伤和脓疮。近期研究表明，对植入Lewis肺癌细胞的小鼠用诺丽果汁每日进行腹腔注射，能明显提高小鼠寿命，这一发现说明其对小鼠免疫系统具有刺激作用。其他研究成果表明海巴戟根的氯仿提取物，即一种名为虎刺醛的蒽醌化合物能诱导ras转化细胞表型的正常化。该研究报道了海巴戟果汁的杭血管生长效果的相关数据。

2 材料与方法

2.1 海巴戟

pH值调至7.4，以130 Kgav的转速离心18h以去除残留的细胞碎片，并用0. 2μm的Nelgene过滤器进行过滤灭菌处理。

2.2血管生长模型

根据路易斯安那州立大学健康科学中心(LSUHSC)内审委员会(IRB)的认可协议，胎盘静脉血管从匿名志愿者的废弃胎盘中取得。将取出的静脉血管纵向切开，以使较厚的静脉组织以平面薄膜的形式充分展现。并利用无菌表皮切割器制造了若干直径2mm的静脉盘。这砦静脉盘之后被放人标准96孔培养板中，培养板内已预置入凝血酶溶液(0.05IU，2μl/孔)，并在使用前蒸发干燥。静脉盘在3小时内完成预处理过程，以确保内皮细胞的活性。来自不同志愿者的静脉盘在各治疗组之间随机分布，以减少抽样误差。

之后，将静脉盘覆盖以100μl血栓介质(HP-VAM)，该介质中含有纤维蛋白原(3毫克/毫升)(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)和E-己酸(0.5%) (Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)。HPVAM由介质199(美国英杰生命技术公司，马里兰州盖瑟斯堡)，抗生素/抗真菌溶液(100荜位青霉素，100单位硫酸链霉素和0.25μgβ/mL两性霉素)(美国英杰生命技术公司，马里兰州盖瑟斯堡)和内皮细胞生长培养基(25%)(美国英杰生命技术公司，马里兰州盖瑟斯堡)制成。将上述物质混合制成凝块，在6%二氧化碳，94%空气，37℃条件的可增湿孵化机中进行培养。介质成形后，对含静脉盘的凝块补充100μl含20%胎牛血清的HP-VAM，单个板孔液体体积为200μl。

2.3血管生长情况的评估

利用20倍或40倍显微镜，以标准化计量网格为参考，进行显微观察测量，利用此方法可对所有板孔的血管生长萌芽情况每隔一天进行一次评估。血管生长以两个标准进行评估。第一，新血管生长比率，以从静脉盘外周生长的大约长度0.5mm的至少三个血管生长芽的形成为增生界定。基于可视化评分系统的血管生长指数(AI)是第二个用于在本研究中量化札管生长的参数。每个静脉盘分为四个象限，并从0到4对血管生长情况评分。将所有4个象限上的分数累加，并且血管生长指数将以一个范围为0到16的分数进行描述。这一方法使我们能够客观地评价实验中的各个孔板中血管生长的程度。平均血管生长指数在观察者组(n=4)之间与治疗组之间的相关性很妤(90%或更高)。通过图像分析评估发现血管平均长度与血管平均生长指数具有较高的相关度。

2.4 血管网的退化

经过7天在HPVAM中的生长，120个血管外植体随机分为测试组与对照组(每组各60个孔板)。60个孔板用含10%的诺丽果汁处理，另60个对照组孔板则用含10%的0.15摩尔氯化钠溶液处理。所有孔板都补充了新介质(包含10%诺丽果汁或10%氯化钠)并每隔两天评估一次血管生长的情况。在实验结束时，诺丽处理组和对照组的活性也将进行以网唑翁盐为基础的检测(MTT法测定活性套件，普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星)。

2.5细胞凋亡

我们利用S7100 ApopTag过氧化物检测试剂盒(Intergen公司，帕切斯，纽约)对10个海巴戟处理组和10个对照组血管外植体进行程序性细胞死亡，即细胞凋亡的检测。这一试剂盒的工作原理是基于检测DNA片段的末端标记法(TUNEL)，利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将单链或者双链DN游离的3'-OH末端进行酶标记。我们可以发现，在细胞核破碎和细胞发生凋亡时，3'-OH端被标记的DNA数量明显增加。然后可以用抗地高辛过氧化物酶检测地高辛标记的DNA。简而言之，组织外植俸以10%福尔马林处理，并固定于石蜡中制成石蜡切片，之后用去除石蜡的切片用蛋白酶K(20μg/mL.Oncor公司)处理15分钟。内源性过氧化氢酶用含2%过氧化氢的PBS溶液处理15分钟，然后漂洗切片，再用平衡缓冲液处理15秒，清除过量的平衡液，并立即加入末端脱氧核苷酸转移酶，将载玻片置于37℃温箱中进行孵育。停止加入洗涤缓冲液，再另外孵育10分钟，并将切片在PBS中洗涤3次，再用两滴抗地高辛过氧化物酶温育30分钟。载玻片用PBS洗涤3次，切片用DAB处理4-6分钟。之后载玻片用苏木精复染，在二甲苯中脱水，并进行显微观察。

图1随着时间推移，血管网络生长情况。图(A)显示，在可拎的条件下增殖进行一周的情况(20倍放大)。图(B)显示，在呵控的条件下增殖进行两周的情况(20倍放大)。图(C)显示，血管网络形成的图像(40倍放大)。

2.6数据

诺丽处理组与对照组利用t检验法进行检验比较。数据符合t检验法的假设。所有统计检验均为双侧检验。

3 结果

本研究显示胎盘静脉外植体的血管在实验开始后的第24天开始生长。虽然是在控制条件下，外植体生长的血管数目不同，但大多数起始率都可达70-95%，少数起始生长率低70%外植体可以忽略不计。图1证实了在两周时间内胎盘外植体的血管生长和生长是可控的。

图2 (A)不同浓度的诺丽果汁对人胎盘静脉外植体的血管生成的抑制效果。诺丽果汁在130Kgav下进行离心，通过一个0.2微米滤孔的滤器过滤，酸碱度调整为7.4。所有诺丽宾验的代表数据来自于不同诺丽浓度的3个胎盘上面的60个外植体。通过控制使介质处于同样的体积(2.5%，5%，10%)，添加0.15摩尔的氯化钠以保证观察结果不受营养介质多样性的影响。在图中的控制点代表添加5%的氯化钠。2.5%的对照对比2.5%诺丽P=ns; 5%的对照对比5%诺丽P<0.001; 10%的对照比对10%诺丽P<0.001。(B)剂量响应通过诺丽果汁抑制血管生长和扩散，正如图2A中所述。介质(MPVAM)通过小同浓度的诺丽果汁的添加来得到三个实验剂量(l0%诺丽n=120，5%诺丽n= 120，2.5%诺丽n=60)。对照组(n =120)，在MP-VAM介质中培养，提供相同的体积(2.5%，5%，l0%)用0. 15摩尔的氯化钠补充在实验系列中由诺丽提供的营养介质的损失。只有5%的对照控制量在图显示中。对照组对比2.5%诺丽P=0.005;对照组对比5%诺丽P<0.001;对照组对比l0%诺丽P<0.001。

图3 (A)诺丽果汁抑制血管生成网络的情况。在l00%的生长介质中培养七天，在生长介质中添加10%的诺丽果汁处理来自于三个胎盘的30个外植体;在生长介质中，来自于同一个胎盘的30个可控的外植体用10%的氯化钠处理。所有介质的酸碱度应平衡到7.4。介质每两天更换一次，同时进行计数。两种处理的差异是十分显著的，P<0.05。(B)诺丽果汁抑制毛细血管生成网络的情况。在生长介质中培养七天，在生长介质中使用10%的诺丽果汁处理来自于两个胎盘的30个外植体;在生长介质中，来自于同一个胎盘的30个可控的外植体用10%的氯化钠处理。所有介质的酸碱度应平衡到7.4。介质每两灭更换一次，同时进行计数。两种处理的差异是十分显著的P<0. 05。

诺丽果汁的剂量效果是通过测试各种诺丽浓度抑制血管生长和血生长的疗效而得出的。图2显示，当在5%和10%的诺丽果汁中添加生长介质时，诺丽对抑制血管生长具有较高的效率，而浓度为2.5%的诺丽果汁则失去抑制血管生长的效果，但是在培养基中添加2.5%的诺丽果汁却可以有效地(P=0.005)降低毛细血管的生长和扩散速率(尽管诺丽含量小于5%和10%)，参见图2B。

将胎盘外植体培养一周，然后置于10%的诺丽果汁中或10%的氯化钠HPVAM中，以观察诺丽对抑制血管生长及破坏血管网方面的效果(图3A和3B)，10%的氯化钠作为埘照组实验，其不会财血管的生长产生任何抑制作用。利用MTT法进行分析，处理实验组显示为深蓝色，表明诺丽处理过的小孔中细胞发生凋亡。此外，大多数实验结果显示诺丽处理之后血管完全退化，且观察不到血管的生长(见图3A)。而在外植体中，诺丽处理七天之后，血管组织虽然保持存活状态，但其形态大为减小，血管网络的复杂程度也大为降低(图3B)。血管退化是由其细胞凋亡过程中产生的一个类似于球形的小泡导致的(图4和5)。使用TUNEL实验(参照“实验材料与方法”)，我们发现用10%的诺丽培养基处理，可以在很大程度上可以诱导细胞凋亡(表1)。

人类乳腺癌外植体置于l0%的诺丽培养基培养两周，与对照实验组相比，诺丽处理组人类乳腺癌外植体的生长率明显下降(图6A)。此外，与对照实验组相比诺丽处理组外植体血管生长的发生率显著降低(P=0.009)(P=0.02，图6B)。

图4诺丽对已建立起来的毛细血管网络的作用呈现在以上三个图中。图(A)显示的是一周内在可控的环境下毛细血管的生长(2倍放大)。(B)显示的是在同一外植体上，经过7天10%诺丽果汁的处理效果(20倍放大)。(C)是一个B图局部的放大，证实血管网的降解是十分明显的(40倍放大)。

图5这两张图显示的是10%的诺丽果汁处理七天之后诱导细胞凋亡的结果，圈A显示血管牛长外植体上，图B是在10%的NaCl HPVAM环境中继续生长到完伞成形的血管网络(40倍放大)。

4讨论

通过本研究可证实海巴戟的果汁有以下功效：(1)在人类胎盘的静脉外植体中抑制新血管的生长;(2)降低毛细血管的增殖率及静脉盘血管网络的生长;(3)在新形成的血管网络中诱导细胞凋亡;(4)在人类乳腺癌外植体中抑制血管发生和血管发育。与之前的研究(腹腔注射的诺丽果汁可抑制小鼠体内Lewis肺癌细胞外植体的增殖)相反，本研究发现诺丽在血管增殖的过程中没有表现激活免疫系统的功能，因而白细胞未在人类静脉盘中培养出来。该效果没有表现出与虎刺醛类似的生理功能，正如我们发现诺丽的氯仿抽提物对血管生长无抑制作用一样(数据尚未报道)。

虽然可从现在得到的实验结果看出，诺丽果汁能够诱导细胞凋亡，这意味着临床治疗中使用诺丽会减少的血管网的形成，很可能依赖于一个完全不同的机制以阻断血管的生成，其中包括：降解蛋白质水解基质;内皮细胞的增殖;内皮细胞的迁移;毛细血管的生成;血管网络的吻合可能抑制血管生成。我们发现，如图1所示，在培养基中加入2.5%的诺丽果汁，对阻断血管生成没有效果(图IA)，但对血管的生长有重要的作用(图1B)。在我们前期研究中已弄清了诺丽中的抗血管生成的组分，发现活性分子既不是蛋白质也不是脂类物质，但当用偏高碘酸钠降解碳水化合物分子时，其可以发挥阻止诺丽对血管生成的效果(数据未显示)。

图6 (A)为人类乳腺肿瘤，34个一毫米的外植体在96孔板上进行培养，分成一个控制群(n=17)，用HPVAM+ 10% NaCI进行培养，测试组用HPVAM+ 10% Noni培养。两组介质均将pH值调至到7.4，并过滤除菌。不同处理手段和控制群差异是罹著的，P=0.006，使用Wilcoxon标记测试法测定。(B)是人类乳腺肿瘤，34个一毫米的外植体在96孔板上进行培养，分成一个控制群(n=17)，用HPVAM+ 10% NaCl进行培养，测试组用HPVAM+ 10% Noni培养。两组介质均将pH值调至到7.4，并过滤除菌。小同处理手段和控制群差异是显著的，P=0. 002

经过七天的处理，外植体被固定、切片、使用TUNEL实验检测细胞凋亡，使用苏木精进行复染色。在玻片上的三个随机区域进行细胞凋亡检测(过氧化物酶染色)和细胞核完整性检测(苏木精染包)。

正如前面所提到的那样，内皮细胞可以静止或激活的状态存在。另一项研究显示内皮细胞的流动状态

表1在HPVAM中进行七天培养，去除生长介质，10个外植体在HPVAM和10%氯化钠的混合物中培养，10个其他的外植体在含有10%诺丽的HPVAM中培养的效果。

外植体数 细胞计数 %细胞凋亡 %细胞核完整性
诺丽    10    981    85%    14%
对照组    10    643    6%    94%

可以决定它们诱导细胞凋亡的敏感性。有一例实验就是内皮细胞通过蛋白酶抑制剂来诱导细胞的凋亡，内皮细胞增殖需要340倍的低浓度蛋白酶体抑制剂PSI以诱导细胞的凋亡17%。如果诺丽治疗产生的诱导细胞凋亡的机制类似于毛细血管处于汇合的状态内皮细胞，肿瘤已经建立的血管网可能能够抵抗诺丽的治疗，这将使诺丽能够有效地阻止新的血管的生成，而保留完整的成熟血管。然而，新形成的毛细血管的易感性如图3和图4所示，在新形成的血管网络，如肿瘤血管网中，存在高浓度的血管生长因子，血管内皮细胞很可能存在于有助于促进血管生成的环境中，从而增加了细胞凋亡诱导剂，正如诺丽的治疗效果。

诺丽抗血管生成功效的一种可能的机制，是通过与细胞表面的结构，如αv整合素的相互作用。另一项研究显示，血管生成可能受多种多样的细胞因子所诱导，可以与至少两个不同的整合素介导的血管生成途径相关。诺丽可在碳水化合物等活性成分存在下，与某些生长因子相联合发挥萁竞争性抑制剂作用。最近的研究结果表明，有许多细胞因子的糖分子识别域及生物活性依赖于与碳水化合物的结合。由此可以推断整合素的拮抗剂可通过诱导新生血管细胞的死亡，进而促进肿瘤的消退。

而这是否是诺丽真正的作用机制，目前仍在积极的研究过程中。